Природа против рака
(Научное исследование, перевод без адаптации.)
Крайнюю агрессивность протоковой аденокарциноме поджелудочной железы (КПК) была связана с заблокированными разрыв junctional межклеточной коммуникации (GJIC) и наличие раковых стволовых клеток (ЦОК). Мы исследовали, является ли нарушенный GJIC отвечает за фенотип КГО в установленных и первичного рака клеток и тканей пациентов из КПК, используя междисциплинарные методы, основанные на физиологии, клеточной и молекулярной биологии, гистологии и эпигенетика.
Тобиас Форстер,#1,2 Ванесса Рауш,#1,2 Yiyao Чжан, Орхан Исаев,1,2 Катарина Хайлмана,3 Откровенный Schoensiegel,1,2 Литий Лю,1,2 Мишель Nessling,4 Карстен Рихтер,4 Сабрина Labsch,1,2 Клиффорд С. Nwaeburu,1,2Юрген Маттерн,1,2 жюри Gladkich,1,2 Гиз Наталья,2 Йенс Вернер,2 Петра Schemmer,2 Вольфганг Гросс,1,2 марта М. Гебхардт,1,2 Кларисса Gerhauser,3 Майкл Шефер,1,2 и Ингрид герр1,2
Реферат
Крайнюю агрессивность протоковой аденокарциноме поджелудочной железы (КПК) была связана с заблокированными разрыв junctional межклеточной коммуникации (GJIC) и наличие раковых стволовых клеток (ЦОК). Мы исследовали, является ли нарушенный GJIC отвечает за фенотип КГО в установленных и первичного рака клеток и тканей пациентов из КПК, используя междисциплинарные методы, основанные на физиологии, клеточной и молекулярной биологии, гистологии и эпигенетика. Поток люминесцентных красителей и гемцитабин через щелевые контакты (чугун с шаровидным графитом gjs) был цел в менее агрессивные клетки, но не в высоко злокачественных клеток с морфологическими неблагополучных чугун с шаровидным графитом gjs. Среди нескольких коннексинов, только Cx43 была выражена на клеточной поверхности менее агрессивным и GJIC-компетентных клеток, тогда как экспрессия Cx43 поверхность отсутствовала в высоко злокачественную, Е-кадгерин-отрицательные и GJIC-некомпетентных клеток. Уровни общего белка Cx43 и Cx43 фосфорилированных на Ser368 и Ser279/282 были высокие в нормальных тканях, но низкие в отсутствии в злокачественной ткани. Си-РНК-опосредованного ингибирования экспрессии Cx43 в GJIC-компетентных клеток предотвращало GJIC и индуцированной колонии формирования и выражения из стволовых клеток-связанных факторов. Биологически активное вещество сульфорафан усиленной Cx43 и Е-кадгерина уровнях, тормозил КСК маркеров с-met и CD133, улучшилась функциональная морфология чугун с шаровидным графитом gjs и усиленной GJIC. Сульфорафан измененное фосфорилирование ряда киназ и их субстратов и ингибирования GSK3, JNK и pkc предотвратить сульфорафан-индуцированной экспрессии CX43. В сульфорафан-опосредованной экспрессии Cx43 не коррелирует с усиленной экспрессии Cx43 РНК, связывания ацетилированного гистона и Cx43 промоутер де-метилирование, предполагая, что посттрансляционного фосфорилирования является доминирующим механизмом регулирования. Вместе, отсутствие Cx43 предотвращает GJIC и повышает агрессивность, в то время как сульфорафан противодействует этому процессу, и наши результаты свидетельствуют о диетических сопутствующее лечение как приемлемый вариант лечения для КПК.
Введение
Панкреатическая протоковая аденокарцинома (КПК) является одной из самых агрессивных злокачественных опухолей и обычно диагностируется в поздней стадии [1]. Гемцитабин является стандартной терапии распространенного рака поджелудочной железы [2] но ни гемцитабин, ни новее FOLFIRINOX комбинированной терапии не нацелены непосредственно на раковые стволовые клетки (КСК) проводящих путей, ответственных за рост, метастазирование, высокая стойкость к текущей терапии рака и рецидивов [3-5].
В горчичном масле сульфорафан, который присутствует в высоких концентрациях в брокколи и капуста [6], имеет хорошо документированный рак профилактической эффективностью и недавно было показано, ингибирует гистон deacetylases (HDACs) [7]. Наши последние результаты показали, что сульфорафан сенсибилизирует ЦОК поджелудочной железы к химиотерапии путем ингибирования их самообновления, потенциал, устойчивость к апоптозу и NF-кв-активности [8-11]. На основе нескольких перспективных животных и эпидемиологических исследований, проспективных клинических испытаний сульфорафана-обогащенный экстрактами брокколи прорастают продолжаются в США для изучения влияния на атипичные невусы, мочевого пузыря и предстательной железы [12], и экспериментального изучения в последнее время стали в нашей клинике для оценки эффекта эта стратегия питания на больных с распространенным КПК.
Ингибирование разрыв junctional межклеточной коммуникации (GJIC) могут быть вовлечены в поведение автономной ДПМ, потому что GJIC возлагает функции отсутствуют в стволовые клетки, а именно контактного торможения [13], апоптоз чувствительности [14] и терминальной дифференцировки [15]. Щелевые контакты (чугун с шаровидным графитом gjs) каналы в плазматической мембране, которые позволяют прямую связь между клетками путем пассивного транспорта ионов и малых молекул [16]. Гемцитабин и других химиотерапевтических препаратов также диффундируют из клетки к клетке через чугун с шаровидным графитом gjs [17], и этот так называемый “эффект свидетеля” ведет к повышению концентрации клеточных цитотоксических агентов [18]. Чугун с шаровидным графитом gjs образуются семьи из более чем 20 различных коннексинов, и измененной экспрессии коннексина участвует в канцерогенезе и сопротивление терапии [19]. Отсутствие чугун с шаровидным графитом gjs-это общая характеристика плюрипотентных стволовых клеток. Однако клетки, полученные из стволовых клеток, например, клеток-предшественников, функционально чугун с шаровидным графитом gjs, предполагая, что GJIC развивается в процессе дифференциации [20-22]. Недавно, в человеческой глиомы сфероидальных культур, снижение GJIC и очень низкий уровень Cx43 были идентифицированы как медиаторы самообновления, инвазивность и восстановительного потенциала, воздействуя на Е-кадгерина выражение, маркеров эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ) [23]. Фосфорилирование Cx43, наиболее выражена повсеместно коннексин, была вовлечена в регуляцию GJIC в несколько этапов, например, экспорт белка к плазматической мембране, образование и активность чугун с шаровидным графитом gjs и коннексина деградации [24]. Например, инактивация erk1/2 и р38 мар-киназ путем сульфорафан было предложено ингибировать ч2О2-индуцированное фосфорилирование Cx43 и блок GJIC в крысу нормальных клеток печени [25]. Кроме того, эпигенетические механизмы могут быть задействованы в регуляции уровня белка Cx43, поскольку предыдущие исследования продемонстрировали, что ингибитор селективного воздействия на 4-phenylbutyrate повышенная экспрессия Cx43 в панкреатических раковых клеток и содействует ингибирование роста ксенотрансплантатов опухолей [26]. Аналогично, hypermethylation из Cx43 промоутер был коррелирует с низкой экспрессии Cx43 в человеческих глиом и рака легких [23, 27].
В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что степень КБК характеристики и гемцитабин сопротивление напрямую коррелирует с дисфункциональными GJIC благодаря низким или отсутствующим уровнем белка Cx43. Наши результаты дают новое механистическое понимание стволовых клеток сигнального и предлагаем пищевую стратегию, состоящую из сульфорафан-содержащих овощи семейства крестоцветных для восстановления дефектных GJIC в поджелудочной железы, которые могли бы способствовать повторной сенсибилизации к текущей химиотерапевтических препаратов.
Результаты
Потеря GJIC коррелирует с КСК-подобный фенотип и гемцитабин сопротивления
Для оценки взаимосвязи между GJIC и терапевтическая резистентность, 3 КПК устоявшихся человеческих клеточных линий с различным уровнем чувствительности терапии были пролечены 50, 100 или 3000 нм гемцитабин и жизнеспособность клеток изучали с помощью МТТ 72 ч после лечения. В самой низкой дозе, жизнеспособность клеток была снижена со 100% до 34, 82 и 95% в чувствительных BxPc-3, производные гемцитабина-упорный subclone BxPc-3-камень и упорный Цнап-1 клеток, соответственно, с сопоставимой реакции при более высоких концентрациях гемцитабина (фиг. 1А). Этот результат был подтвержден путем измерения апоптоза с помощью аннексина окрашивание и facs-анализа (фиг. 1А). В гемцитабин сопротивление КПК клеточных линий коррелирует с количеством КБК характеристики, такие как р53 и K-RAS с статуса, морфологии, самообновления потенциал, восстановительного потенциала и экспрессии Е-кадгерина и виментин (Таблица С1). В следующих экспериментах эти клетки были использованы в качестве в пробирке моделей для PDA с низким (BxPc-3), медиана (BxPc-3-жемчужина) и высоком (Цнап-1) КБК характеристики. Мы microinjected мембрана-непроницаемых но ГДЖ-проницаемых флуоресцентного красителя Люцифера желтого [30] и документально диффузии флуоресценции соседних клеток методом флуоресцентной микроскопии и видео записи. Для анализа данных серых значения интенсивности флуоресценции были оценены обработки изображений и серой значения непосредственно вводят клетки был установлен к 100% (фиг. 1Б, В). Серые прямые значения соседних ячеек в первой строке, окружающие вводят клетки были 50, 20 и 0% в BxPc3, BxPc-3-камень и Цнап-1 клеток, соответственно. Окрашивание косвенных соседей, расположенных во втором ряду был обнаружен в BxPc-3 клетки всего. Этот результат отражен в оценке означает серо значения всех соседних клеток в каждой клеточной линии, которая была наиболее высокой в BxPc-3 клетки (Рис. 1Д). Блокада чугун с шаровидным графитом gjs с 18αGA был использован в качестве отрицательного контроля и полностью предотвратить диффузию Люцифер желтый во всех клеточных линиях, как и ожидалось (фиг. 1С, Д). Эти наблюдения были усилены путем совместного исследования с использованием инкубации с флуоресцентно-меченых клеток с последующим изучение интенсивности флуоресценции в немеченые клетки-мишени и путем совместной инкубации гемцитабин-обработанные и необработанные клетки и изучение гемцитабина эффект свидетеля (фиг. С1).
Чтобы оценить, является ли снижение экспрессии коннексина конкретного отвечает за обесцененные GJIC, мы исследовали экспрессию структуры стандарта коннексинов Cx32, 26, 36, 45 и 43 с помощью Вестерн-блот анализа. А Cx26, 32 и 36 уровней были улучшены в BxPc-3-камень и Цнап-1 клеток по сравнению с BxPc-3 и доброкачественных, увековечен протоков поджелудочной железы СЛС-4023 клеток, Cx43 и 45 уровни были снижены в более злокачественных клеток, с сильнейшими эффектами, наблюдаемыми для Cx43 по сравнению с BxPc-3 и СЛС-4023 клеток (фиг. 2А). Поскольку экспрессия коннексинов на поверхности клетки необходим для ГДЖ функциональность, мы оценивали на клеточной поверхности выражении путем двойной иммунофлюоресценции stainings на поверхности клеток маркера EpCAM в сочетании с Cx26, 32, 36, 43 или 45. В соответствии с результатами Вестерн-блот, флуоресцентной микроскопии выявлена сильная экспрессия Cx43 на клеточной поверхности BxPc-3 клетки; впрочем, это выражение уменьшилась в BxPc-3-жемчужина и полностью отсутствует в Цнап-1 клеток (фиг. 2Б). Окрашивание структуры всех других коннексинов были диффузными во всех клеточных линиях без выраженной клеточной поверхности выражение (Рис. С2), который утверждает, что основную роль в присвоении функциональных чугун с шаровидным графитом gjs. Кроме того, электронная микроскопия выявила наличие функциональных чугун с шаровидным графитом gjs в BxPc-3 клетки, как тесно в отличие от мембран, разделенных слабый щель были видны (Рис. 2С). В отличие от разрыва-подобных структур между соседними Цнап-1 клетки характеризовались одинаковым шагом и зазоры заполняют контрастным материалом. Эти пробелы были слишком широки для обычных массивов ГДЖ; таким образом, наши данные позволяют предположить, что нефункциональные чугун с шаровидным графитом gjs присутствуют в Цнап-1 клетки, которая, скорее всего, из-за отсутствия Cx43 на клеточной поверхности.
В хирургически резецированных тканей поджелудочной железы человека мы обнаружили высокие уровни фосфорилированных Cx43 на Сир и Сир 368 в 279/282 при доброкачественных ткани поджелудочной железы, полученных из 6 доноров органов, но не в КПК злокачественной ткани, полученных от пациентов 6 (фиг. 3А, Б). Эти данные были подтверждены в дополнительной КПК тканей, полученных из 3 пациентов, в которых общая Cx43 полностью отсутствовал в злокачественные частях секций, но присутствует в доброкачественных деталей каждого отдельного ткани (Рис. 4А). Это коррелирует экспрессия Е-кадгерина, которая была высказана в нормальной ткани поджелудочной железы, но не в злокачественной ткани поджелудочной железы, также осмотрен двойного иммунофлюоресцентного окрашивания общая Cx43 и e-Кадгерина с последующим флуоресцентной микроскопии (фиг. 4Б).
Ингибирование Cx43 предотвращает GJIC и способствует агрессивности опухоли
Для дальнейшего выяснения функции Cx43 для GJIC и CSC функции поджелудочной железы, мы в нокдауне Cx43 в странах с низким злокачественным BxPc-3 клетки по Cx43-Режиссер siрнк. По сравнению с неспецифическими контрольной siрнк, 2 из 5 протестированных специфические siрнк полностью подавлена экспрессия Cx43 белка в концентрации 50 пмоль, и сильнейшие эффекты наблюдались через 3 дня после трансфекции, как оценивали путем Вестерн-блот-анализа (фиг. 5А, фиг. В S3). Для последующих экспериментов, мирнк-трансфицированных BxPc-3 клетки были microinjected с Люцифером желтый, сопровождаемый видео-анализ красителя диффузии и анализ значения серого цвета. Клеток, трансфицированных siрнк по сравнению с контролем, специфические siрнк таргетинг Cx43 снизилась средняя окрашивание соседних ячеек в первой ячейке строки с 50 до 30% и во втором ряду от 20 до 15% (Рис. 5Б). Параллельно, жизнеспособность Cx43 siрнк-трансфицированных BxPc-3 клетки увеличены и гемцитабин эффект свидетеля был полностью упразднен, измеряемая совместную инкубацию гемцитабина окрашенных и необработанных клеток (фиг. 5С). Кроме того, отрицательная регуляция Cx43 усиленной колонии-образующих емкость (Рис. 5Д) и привело к индукции стволовых клеток-факторы, связанные в том числе Октябрь-3/4, Nanog, и добавление sox2 ведет к усилению TP65 а также ЕМТ-связанных транскрипционных факторов Улитка, как измерено с использованием антитело-белок массива (фиг. 5е).
Сульфорафан повышает уровень белка Cx43 и GJIC и изменения Cx43 фосфорилирования структуры
В попытке усилить экспрессию Cx43 восстановить GJIC и ингибировать КБК характеристики, мы провели процедуры с сульфорафан, и исследовали экспрессию Cx43 с помощью Вестерн-блот анализа. В сравнении с необработанным контролем клеток, сульфорафан сильно увеличилось количество общего Cx43 во всех клеточных линиях проверил (фиг. 6А). Базальная Cx43 фосфорилированных на Гээ 368 оказался самым высоким в BxPc-3 клетки. Сульфорафан привело к зависящую от времени повышение низкого базального уровня Cx43 фосфорилированных на Гээ 368 уже 2 ч после обработки в BxPc-3-камень и Цнап-1 клеток, тогда как высокая базальная экспрессия в BxPc-3 клетки был не больше возросло, а скорее уменьшилось. Более того, экспрессия Cx43 фосфорилированных на Гээ 279/282 был увеличен на сульфорафан лечения во всех 3 клеточных линий. Сульфорафан также индуцированной экспрессии Е-кадгерина во всех 3 клеточных линий, но сильнее экспрессия наблюдалась в 2 больше агрессивных клеточных линий, демонстрирующих ниже базальных уровней. Чтобы оценить, является ли сульфорафан-опосредованную индукцию экспрессии Cx43 сопровождалось усиленной GJIC, мы microinjected Люцифера желтого в сульфорафан необработанные или обработанные BxPc-3-жемчужина клеток. Видео анализ диффузии красителя и анализа серый значений показало, что сульфорафан увеличилась GJIC (фиг. 6Б). Результаты электронной микроскопии коррелируют с этими выводами, в качестве контрастного материала в зазор структур между соседними Цнап-1 клеток уменьшилась после лечения сульфорафан (фиг. 6с) по сравнению с необработанной Цнап-1 клеток (фиг. 2С). Наконец, ингибирование GSK3, РКС и JNK с помощью ингибиторов БИО, staurosporine и SP600125, соответственно, уменьшила сульфорафан-индуцированной экспрессии Cx43 общего и фосфорилированного Cx43 в сер 368 как показано в Цнап-1 клеток (фиг. 6Д). Этот результат, вместе с выводом о том, что сульфорафан влияет на фосфорилирование многочисленных киназ и их субстратов в зависимым от времени образом (фиг. С4) предполагает, что postranslation фосфорилирования участвует в усиленной экспрессии Cx43. В противоположность этому, сульфорафан не активируют экспрессию Cx43 мРНК, измеряемая сделать qrt-ПЦР (фиг. С5); не увеличивать деметилирования из Cx43 промоутер, измеряемый количественный анализ метилирования GJA1 (Cx43) Гена (фиг. С6); и не повышают связывание гистонов ацетилированный к GJA1 промоутер как измерено методом иммунопреципитации хроматина гистоны ацетилированный 3 и 4 с последующим анализом нескольких регионах, окружающихGJA1 сайт начало транскрипции с помощью qPCR (фиг. S7-Сибирь). Удивительно, расширенные метилирования промотора Cx43 в неочищенных Цнап-1 клеток по сравнению с BxPc-3 и BxPc-3-жемчужина клеток была обнаружена (Рис. С6), которая может быть ответственной за необнаруживаемых экспрессия Cx43 мРНК в Цнап-1 клеток (фиг. С5). Таким образом, повышенные уровни белка Cx43 после сульфорафан были скорее всего из-за изменения фосфорилирования и стабилизации белка Cx43; хотя фосфорилирования узор Cx43 варьировала между клеточными линиями, которые в соответствии с недавним отчетом [31].
Для дальнейшего выделения этих выводов в первичной КСК-маркер-позитивных клеток, мы выбрали первичный ЦОН по трансплантации свежей КПК резецированной ткани из двух пациентов иммунодефицитных мышей. Для обогащения ЦОК мы subtransplanted в ксенотрансплантатов в течение нескольких раундов. Во время subtransplantation, морфологии опухоли и опухоли стромы были в значительной степени сохранены, как обеспечивается специальная окраска окрашивание первичной опухоли и ее ксенотрансплантатов (фиг. 7А и данные не показаны), в то время как латентность и опухоль процентная ставка увеличивается (данные не показаны). Соответственно, КБК маркера с-встретил обогатилась от 17% в первичной опухоли до 32% в ксенотрансплантатов на прохождение 3. Экспрессия Cx43 фосфорилированных на Гээ 368 была также обнаружена в первичной опухоли тканей и ксенотрансплантатов; однако количественные оценки не представлялось возможным ввиду экспрессию Cx43 между соседними клетками. Изучить влияние сульфорафана на КСК функции, мы дополнительно обогатили КСК-маркер позитивных клеток от прохода 7 ксенотрансплантатов из 2 пациента опухоли путем изоляции опухолевых клеток и в пробирке сфероидальные культуры (Рис. 7Б). Этот метод культуры благоприятствовало росту ЦОК, поскольку возможность выращивать анкоридж-независимый рассматривается как свойство ЦОК, и это проявляется как в повышенной экспрессии маркеров ЦОК с-мет (~ 75%) и CD133 (~ 80%), выявленных по подготовке cytospins и иммуногистохимии (фиг. 7С). Кроме того, лечение сфероидальных культур с сульфорафан за 24 ч вырос уровень экспрессии Cx43 фосфорилированных на Гээ 368, Е-кадгерина и активной каспазы 3, в то время как уровни с-met и CD133 снизилась. Эти результаты демонстрируют, что экспрессия Cx43 низкая в первичных ЦОК, но может быть увеличена путем обработки сульфорафан, который связан с ингибированием КСК и ЕМТ и маркеры индукции апоптоза.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить г. Moldenhauer для предоставления мышь mab анти-EpCAM и С. Бауэра и Э. Сойка за отличную техническую помощь. Это исследование было поддержано грантами от немецкой помощи онкологическим больным (в Deutsche Krebshilfe, ТС/110079 ИЖС; ИЖС 109362), немецкого исследовательского общества (dfg он 3186/11-1), немецким Федеральным Министерством образования и научных исследований Германии (bmbf 031A213), немецко-израильский Фонд научных исследований и развития (GIF в 1058-7.11/2008), в Ханнс А. Pielenz Штифтунг", в отеле heidelberger Штифтунг хирургии и Фонда рака и скарлатина Гейдельбергского университета.
Оставить комментарий