Природа против рака
В настоящем исследовании показан эффект апоптоза, который вызывается пикногенолом, а также его молекулярный механизм по подавлению плоскоклеточного рака ротовой полости (HSC-3 клетки). Пикногенол значительно ингибирует жизнеспособность клеток полости рта и подавляет трансформацию в опухолевые клетки.
ИССЛЕДОВАНИЕ (перевод автоматический без адаптации)
Авторы: Национальный университет Южной Кореи
Дата: январь 2016
Источник: www.ncbi.nlm.nih.gov
Устной плоскоклеточный рак (ККОН) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний, с более 2800 новых случаев диагностированных в Республике Корея за 2011 год.(1)несмотря на все усилия рака биологи для улучшения лечения рака, 5-летняя выживаемость для ККОН (примерно 45-50%) не была сильно возрос за последние два десятилетия.(2) таким образом, открытие противоракового препарата кандидатов для лечения ККОН обязательно еще и продолжает представлять собой реальную проблему.
Апоптоз (запрограммированная смерть клетки) - это путь гибели клеток, что способствует искоренению ненужных и нежелательных клеток, чтобы поддерживать равновесие между выживанием клетки и смерть клетки.(3) оно опосредуется двумя основными путями, внешний путь с участием рецепторов гибели и внутренние пути с участием митохондрий. В частности, митохондрий-зависимого апоптоза процессы регулируются, в основном, исполнителя bcl-2 членами семьи в том числе и анти-апоптотических белков (Оуз-2, Оуз-хl, мкл-1 и bcl-W) и про-апоптотических белков (плохой, ставка, Бим, БИК, Бакс, бак, NOXA и Puma).(4)
Во многих исследованиях сообщалось о широком спектре натуральных продуктов или их производных, которые были использованы в качестве источников для разработки новых лекарств для противоопухолевой терапии.(5–7) Пикногенол-это натуральный растительный экстракт, полученный из коры французской морской сосны (Пинус мариттима). Основные составляющие пикногенол являются фенольные соединения, разделить на мономеры и конденсированные флавоноиды.(8) один из самых критических способностей пикногенол является восстановление капиллярной эндотелиальной целостности противоотечное действие при хронических расстройств, таких как хроническая венозная недостаточность (ХВН).(9) Несмотря на ряд исследований, которые сообщили, что пикногенол имеет портивораковый деятельность,(10,11) маленький был обнаружен еще касающиеся человека рак пока нет.
В этом исследовании мы стремились выяснить влияние пикногенол в человеческом ККОН ГСК-3 клеточной линии и определения его активности-ассоциированный молекулярный механизм.
Материалы и методы
Культуры клеток и химической обработки
Человека устной плоскоклеточный рак клеточной линии, ГСК-3 была любезно предоставлена проф. Синдо (Университет Хоккайдо, Хоккайдо, Япония). Клетки культивировали в среду dmem (WelGENE Инк,. Дэ-ГУ, Корея) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1% пенициллин и стрептомицин при 37°С В 5% со2 инкубатора. Клетки обрабатывали диметилсульфоксидом (ДМСО) или различных дозах (8, 16, 24 и 32 мкг/мл) пикногенол (Carbosynth Лтд.; Комптон, Беркшир, Великобритания) в течение 24 ч. Конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1%.
Трипановым синим отчуждения анализа
Рост-ингибирующее действие пикногенол был определен с синим раствором трипать (Gibco, Пейсли, Великобритания). Клетки окрашивали трипановым синим (0.4%) были подсчитаны с помощью hemocytometer. Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах и результаты выражали как среднее ± SD для каждой группы лечения.
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-ил)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Н-тетразолия, то (МТС) анализа
Жизнеспособность клеток определяли пробирным МТС (Promega, Мэдисон, Висконсин). Клетки высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали с пикногенол в течение 24 ч. Вкратце, решение МТС был добавлен в каждую лунку и выдерживают в течение 1 ч при 37°С. оптическую плотность измеряли при 482 нм с помощью микропланшетного ридера Хамелеон (Hidex, Турку, Финляндия). Данные были выражены как процент жизнеспособности клеток по сравнению с контролем транспортного средства.
Анкоридж-независимые клеточные преобразования анализа (мягкий агар анализа)
Влияние пикногенола на трансформацию опухолевых клеток определяли в JB6 или ГСК-3 клетки. 12-о-tetradecanoylphorbol-13-ацетат (тра; Сигма-Олдрич кемикал ко., Сент-Луис, Миссури)-стимулировали JB6 или ГСК-3 клетки были обработаны с пикногенолом и затем инкубировали в 1 мл 0.3% базальный средний Орла агар, содержащий 10% ФБС. Культуры поддерживали на уровне 37°С В 5% со2 инкубатора в течение 12 дней (JB6) или 10 дней (ГСК-3). После этого, клетки колонии подсчитывали.
Вестерн-блот анализ
Всего-клеточные лизаты были приготовлены с буфером для лизиса и концентрацию белка в каждом образце измеряли с помощью анализа белка набор DC (БИО-рад лаборатории, Мэдисон, Висконсин). После нормализации равное количество белка разделяли SDS-пааг, а затем перевели в Иммун-БлотТМ ПВДФ мембраны. Мембраны были заблокированы с 5% обезжиренного молока в TBST в РТ в течение 2 ч, и инкубировали с первичными антителами и соответствующими ПХ-конъюгированного вторичного антитела. Антитела против ППА колоть, колоть caspase3, бак, Бакс, области bcl-хl, плохо и мкл-1 были приобретены у технологии клеточной сигнализации, Inc. установите (Шарлоттсвилль, Вирджиния). Актин антитела были получены из Санта-Круз-биотехнологии, Inc установите. (Санта-Крус, Калифорния). Иммуно-реактивной полосы были визуализированы с помощью ImageQuantТМ Лас-500 (ГЭ здравоохранения, наук о жизни, Пискатауэй, Нью-Джерси).
Обратной транскриптазы–полимеразной цепной реакции (от-ПЦР)
Тотальную РНК экстрагировали путем простой синий тотальной РНК добыча комплект (ИНТРОН, Тэджон, Корея) в соответствии с инструкциями производителя. Один микрограмм РНК обратная транскрипция TOPscriptТМ Сухих строительных смесей РТ (Элпис биотехнологии, Тэджон, Корея), и полученная кднк подвергали ПЦР с использованием ПЦР-Хипи Премикс (Элпис биотехнологии). В последовательности праймеров были использованы: бак смысле 5'-КТГ КТС ТЦТ ТБГ ТЦТ ГАГ-га-3', бак антисмысловые 5'-КТГ ТСА ГГТ ГГА ПКК кот ТГ-3', ГАФД смысле 5'-КЭУ КЭУ АГТ ЦАА АТТ ГГТ ВРЧ ТАТ-3' и ГАФД антисмысловые 5'-АРУ СТТ КТК кошка ГГТ ГГТ ГАА ПКК-3'. ПЦР состоянии бак был следующим: 32 циклов: 1 мин при 94°с, 1 мин при 62°C и 1 мин при 72°С, А ПЦР состояния ГАФД была такова: 28 циклов: 1 мин при 94°с, 1 мин при 60°C и 1 мин при 72°С. Интенсивность каждой полосы были нормализованы для β-актина. Амплифицированные продукты анализировали в 2% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием.
Активные формы кислорода (АФК) анализа
Клетки высевали на 4-культуры пластины и обрабатывают ДМСО или пикногенол (8, 16, 24 и 32 мкг/мл). Н-Ацетил-л-цистеин (nac) был от Сигма-Олдрич кемикал ко (Сент-Луис, Миссури). Через 24 ч клетки отмывали дважды pbs и 20 мкм 2',7'-Dichlorofluorescin Диацетат (DCFH-да, Calbiochem, Сан-Диего, Калифорния) был добавлен к клеткам в 4-культуры плите в течение 30 мин в 5% со2инкубатора и клетки были затем визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
Статистический анализ
Студента т - тест был использован для определения значимости различий между контролем и терапевтические группы; значения р<0.05 считали статистически значимыми.
Результаты
Пикногенол снижает жизнеспособность клеток и подавляет анкоридж-самостоятельное формирование колонии в ГСК-3 человека устной плоскоклеточный рак (ККОН) клеток
Для того, чтобы наблюдать эффект пикногенол на жизнеспособность клеток ГСК-3 клетки, ЭСК-3 клетки были обработаны с пикногенол в течение 24 ч и жизнеспособность клеток определяли по трипать пробирного голубой изоляции и МТС анализ. Результаты исследования показали, что пикногенол вызвало статистически значимое снижение при использовании в концентрациях 16, 24 и 32 мкг/мл (через 24 ч) в обоих анализах (Рис. 1). СК50 величина оказалась примерно 20 мкг/мл через 24 ч. Для изучения ингибирующего эффекта пикногенол о трансформации опухолевых клеток, мы провели мягкая анализа агар в ДТС-лечить JB6 клеток и ЭСК-3 клетки. Пикногенол резко подавил ДТС-индуцированной анкоридж-независимая трансформация клеток JB6 клеток (Рис. 2А И Б), хотя дозы пикногенол используется (2,5 и 5 мкг/мл) не влияют на жизнеспособность в JB6 клеток (Рис. 2С). Мы также обнаружили, что количество и размер колоний было значительно меньше и меньше, когда ГСК-3 клетки были обработаны с пикногенол в зависимости от дозы образом (фиг. 2д). Эти результаты показывают, что пикногенол может подавлять жизнеспособность клеток и замедления процесса трансформации опухолевых клеток в рак ротовой полости.
Пикногенол причины каспаза-зависимого апоптоза в ЭСК-3 клетки
Чтобы определить, если рост-ингибирующей активности пикногенол может быть связано с апоптотической гибели клеток, мы исследовали эффекты апоптоза пикногенол путем проведения вестерн-блот анализа с использованием антител против расщепляется parp и расщепляется каспазы 3. Как показано на фиг. 3А дозозависимое увеличение уровней экспрессии этих белков был замечен в пикногенол-лечить ГСК-3 клетки. Для того, чтобы подтвердить необходимость активности caspase3 во время апоптоза в линии клеток, мы использовали З-ВАД-ФМК, пан-ингибитор каспазы. Результаты показали, что апоптоз, индуцированный пикногенол был полностью ингибируется З-ВАД-ФМК (Рис. 3Б). Взятые вместе, мы делаем вывод, что пикногенол может эффективно привести к каспаза-зависимого апоптоза в ЭСК-3 клетки.
Пикногенол повышает уровень экспрессии белка бак через пост-трансляционной модификации
Для выяснения молекулярного механизма пикногенол-опосредованного апоптоза, мы исследовали, может ли области bcl-2 семейства белков могут быть причастны к его активности апоптоза. Результаты исследования показали, что пикногенол значительно возрос уровень экспрессии бак белка в зависимости от дозы образом (фиг. 4А И Б), тогда как экспрессия других области bcl-2 семейство белков, в том числе и Бакс, Бад, области bcl-XL и mcl в-1 не регулируется (фиг. 4е). Далее, мы провели от-ПЦР для выявления как пикногенол регулирует белковый бак в ГСК-3 клетки. Как показано на фиг. 4С, пикногенол, не изменяет уровень мРНК бак предполагая, что оно не может регулировать бак белков на уровне транскрипции. Таким образом, мы рассмотрели стабильности белка бак с использованием циклогексимида (СНХ), синтез белка ингибитор. Результаты показали, что совместное лечение пикногенолом и СНХ значительно повышается уровень белка бак при СНХ лечение вызвало лишь незначительное снижение в бак экспрессии белка (фиг. 4д). В целом, пикногенол может увеличить уровень бак протеина путем увеличения ее стабильности белка.
Пикногенол стимулирует генерацию АФК
Предыдущие исследования сообщили, что генерации АФК могут быть причастны к натуральным продуктам-производным апоптоза в Уральске человеческих раковых клеточных линий.(12) для проверки причастности рос в пикногенол-опосредованного апоптоза, мы провели DCFH-Da и анализа в ГСК-3 клеток с помощью люминесцентного микроскопа. По сравнению с контролем, рос-позитивных клеток в пикногенол-опытной группы были значительно увеличены в зависимости от дозы образом (фиг. 5). Для подтверждения участия производства рос в пикногенол-обработанных клеток, НАК, своего рода рос мусорщик был использован. Как показано на фиг. 6, Производства рос был заметно подавлен НАК в пикногенол-лечить ГСК-3 клетки, предполагая, что пикногенол может иметь отношение к генерации АФК.
Обсуждение
Натуральные продукты разрабатываются для лечения распространенных заболеваний человека, включая сердечно-сосудистые заболевания, воспалительные заболевания и генетические нарушения(13) предполагая, что они могут быть привлекательными кандидатами для рака лекарств. Некоторые более ранние исследования показали, что пикногенол уменьшается Тальков-индуцированной неопластической трансформации в человеческих культурах клеток яичников и дополненной активности апоптоза в promyeloid лейкемии человека в HL-60 клеток и раке молочной клетками mcf-7.(8,11,14) Эти исследования, наряду с несколькими другими, которые поддерживают его анти-опухолевой активности, показывают, что пикногенол может иметь противоопухолевой активностью. Таким образом, в настоящем исследовании мы определяли жизнеспособность ГСК-3 ячейки, используя трипановым синим отчуждения анализа и МТС анализ и результаты показали, что пикногенол явно снизилась жизнеспособность клеток на 24 ч с СК50 стоимость 20 мкг/мл. Хуани соавт.(11) (2005) показали, что пикногенол также ингибируют рост HL-60 и U937 и K562 человеческих лейкозных клеток с IC50 значений на 24 ч 150, 40 и 100 мкг/мл, соответственно. Разница в IC50 значений говорит о том, что человека устные раковые клетки могут быть более чувствительны к пикногенол, чем человеческих клеток лейкемии. Сообщалось также, что пикногенол было доказано, чтобы быть мощным агентом химиопрофилактические о чем свидетельствует его способность подавлять превращение опухолевых клеток.(8) Потому что угнетение способности клеток расти на мягкий агар-характеристика перспективных кандидатов противоопухолевый препарат, в процессе исследования определено ли пикногенол бы быть в состоянии препятствовать трансформации опухолевых клеток. Результаты исследования показали, что пикногенол значительно снижается выживаемость клеток, взвешенных в мягкий агар, выводы, которые согласуются с другими предыдущем исследовании.(8) Апоптоз также был обнаружен в ГСК-3 клетки, обработанные пикногенол о чем свидетельствует расщепление parp и каспазы 3. В нескольких исследованиях также обнаружено, что пикногенол индуцирует дифференцировку и апоптоз клетками mcf-7 и HL-60 клеток(11,14) , указывающий, что он может быть мощным индуктором апоптоза в человеческих клеточных линий рака. В предыдущем исследовании, мы сообщали, что пикногенол, оказываемое каспаза-независимого апоптоза в МК-3 человека mucoepidermoid карцинома клеточной линии путем провоцирования ядерной транслокации апоптоз-индуцирующего фактора.(15) Таким образом, мы исследовали, может ли пикногенол-индуцированного апоптоза в ЭСК-3 клетки является каспаза 3-зависимые и результаты показали, что каспаза 3 участвует в его активности апоптоза в отличие от наших предыдущих результатов, означает, что каспаза-зависимость пикногенол является клеточная линия-зависимые. Исходя из этих данных, пикногенол может быть хорошим противоопухолевых препаратов против рака полости рта.
Хотя мы показали, что пикногенол обладает противораковым действием в человеческой ККОН клеточной линии, ее молекулярный механизм, который не был ранее хорошо понимали. Области bcl-2 семейства белков, как известно, контролировать высвобождение цитохрома С, В результате чего митохондрий-зависимого апоптоза клеточной смерти.(16) таким образом, мы рассмотрели возможность, что области bcl-2 семейство белков были вовлечены в молекулярный механизм, связанный с пикногенол-опосредованного апоптоза в ЭСК-3 клетки. Наши результаты показали, что пикногенол увеличивается только бак протеина в то время как другие области bcl-2 белки не были затронуты в этом в пробирке системы. Бак является конститутивно выразил в наружной мембраной митохондрий и его конформационные изменения и олигомеризации происходят в ответ на апоптотические стимулы.(17) дефицит белка в баке был сильно коррелирует с развитием опухоли, приводит к уменьшению продолжительности жизни бака было установлено, индуцируют апоптоз в различных раковых клеточных линий.(18,19) Многочисленные виды противоопухолевых препаратов на функции вверх-регулировать уровни экспрессии белка бак и наши предыдущие исследования показали, что бак-это ключевые молекулы, участвующие в апоптозе рака полости рта человека линии клеток после воздействия экстрактов из некоторых натуральных продуктов-производных апоптоза.(20,21) эти результаты показывают, что бак протеин может быть критической молекулы-мишени в рак полости рта во время его апоптотических действий.
Активные формы кислорода (АФК) уже было показано, для выполнения определенных функций в процессе апоптоза путем регулирования проапоптотических белков, таких как bcl по-2 членов семьи.(22) сообщалось о том, что многие натуральные продукты могут опосредовать апоптоз путем генерации АФК и таким образом оказывать свое противоопухолевое.(23–25) в последнее время, некоторые исследования показали, что xanthorrhizol и goniothalamin вызвало апоптоз, индуцируя рос в человека рак полости рта, рак клеточных линий и ДМБА-индуцированных Уральске канцерогенеза предполагая, что рос может быть эффективный способ действия для натуральный продукт-опосредованного апоптоза.(26,27) многочисленные исследования показали, что пикногенол обладает антиоксидантной активности в клетках карциномы легких человека, высокий уровень глюкозы-обработанных клетках канальцев почки и культивируемых нормальных эндотелиальных клеток.(28–30) с другой стороны, пикногенол сообщили, что это вызвало окислительного стресса у человека фибросаркома и кишечной палочки супероксиддисмутазы и каталазы дефицитом мутантных клеток.(10,31) Это еще спорно, будет ли пикногенол является про-оксидантом или антиоксидантом. Наши результаты показали, что более высокие дозы пикногенола четко выработанной рос в ГСК-3 клетки, подразумевая, что пикногенол может быть про-окислителя в ГСК-3 человека Уральске плоскоклеточной карциномы клетки. Гандин и соавт.(29) ранее предположил, что селен в низких концентрациях может обладать свойствами антиоксиданта, а при средних и высоких концентрациях оказывают мощное про-окислителя эффектов означает, что биологические эффекты Селена может быть зависимым от концентрации. Йен и соавт.(32)сообщается, что фенольные соединения, такие как морен, нарингенин и кверцетин в высокой концентрации были весьма цитотоксических из-за их стимуляции оксидативного стресса, хотя они также обладают антиоксидантными деятельности. Это говорит о том, что про-оксидантное действие пикногенол, как и другие растительные полифенолы могут быть критические механизм его противоопухолевого потенциала.
В заключение, данное исследование впервые показывает, что пикногенол подавляет опухолевые трансформации и индуцирует каспаза-зависимого апоптоза в ЭСК человека ККОН-3 клетки. Это явление может быть обусловлено посттрансляционной модификации белка бак и генерации АФК. На основании этих данных, мы заключаем, что пикногенол может быть мощным кандидатом для химиопрофилактики и химиотерапии рака полости рта.
Благодарности
Это исследование было поддержано программой фундаментальных исследований посредством Национального исследовательского Фонда Кореи (НРФ), финансируемого Министерством образования (2014R1A1A2055874), Министерство науки, ИКТ и будущего планирования (2014R1A4A1005309) и Министерство образования, науки и технологии (ФНО-2013R1A1A4A01013550). Кроме того, данное исследование проводилось в рамках научных фондов из Университета Кванджу, Южная Корея в 2015 году.
Аббревиатуры
| СНХ | циклогексимида |
| ХВН | хроническая венозная недостаточность |
| ККОН | устной плоскоклеточный рак |
| Рос | реактивный вид кислорода |
Конфликт интересов
Никаких потенциальных конфликтов интересов, раскрываются.
Оставить комментарий